LTA BIOCHIMICHE
Il corso è articolato in due parti riguardanti in generale l’applicazione di tecniche biochimiche per la preparazione e la caratterizzazione di proteine dotate di attività enzimatica
Parte I: L’applicazione di differenti tecniche consente l’estrazione e la purificazione a gradi di purezza crescente di un enzima di origine batterica di cui si realizza uno studio di cinetica enzimatica. I risultati del procedimento di purificazione sono valutati qualitativamente mediante analisi elettroforetiche su gel di SDS-poliacrilammide, mentre il dosaggio delle proteine con tecniche spettrofotometriche e la realizzazione di saggi di attività enzimatica consente il calcolo dell’attività specifica e quindi del grado di purezza dell’enzima ottenuto nei vari passaggi di purificazione. Una parte rilevante del corso consiste nell’analisi dei dati e nella valutazione critica dei risultati. Infine il riferimento alla teoria cinetica ed in particolare all’equazione di Michaelis-Menten permette di determinare parametri quali Velocità massima, KM, Kcat e di analizzare il comportamento dell’enzima purificato in presenza di un inibitore.
Parte II: riguarda l’introduzione di DNA in cellule di mammifero ed analisi della sua espressione mediante saggi enzimatici ed analisi della capacità proliferativa di cellule immortalizzate e trasformate in risposta a differenti concentrazioni di fattori di crescita. L’introduzione del DNA viene eseguita mediante trasfezione con metodo del Calcio Fosfato. Tale metodica viene utilizzata per sovraesprimere in cellule trasformate il cDNA codificante per l’enzima beta-galattosidasi. Dopo la preparazione dei lisati cellulari e dosaggio del contenuto proteico, l’espressione della beta-galattosidasi viene in seguito analizzata mediante saggio enzimatico spettrofotometrico. L’analisi in cinetica della proliferazione viene effettuata mediante conta cellulare ed analisi morfologica delle cellule, permettendo di costruire un grafico di proliferazione che identifica la diversa capacità proliferativa delle cellule immortalizzate e trasformate.
Ogni esperimento verrà preceduto da un’adeguata introduzione su tecniche, strumentazione e reagenti da usare e verrà seguito dalla discussione dei dati ottenuti e delle possibili applicazioni delle procedure sperimentali apprese. All’inizio del corso, ogni studente verrà dotato di appropriati protocolli scritti, che descriveranno le procedure sperimentali.
LTA BIOMOLECOLARI
Il corso sarà articolato in esperimenti di laboratorio, per non oltre 50 studenti. In particolare, gli studenti saranno impegnati in esperimenti articolati nel corso di diverse giornate, preceduti da un’adeguata introduzione sia sulla tematica da affrontare che su strumentazione e reagenti da usare e seguito dalla discussione dei dati ottenuti e delle possibili applicazioni e sviluppi delle procedure sperimentali apprese. All’inizio del corso, ogni studente verrà dotato di appropriati protocolli scritti, che descriveranno, per le diverse tematiche da affrontare, le procedure sperimentali da seguire.
Il programma verrà sviluppato analizzando in dettaglio i seguenti punti principali:
1. analisi di acidi nucleici: uso dello spettrofotometro per la definizione di spettri di assorbimento, dosaggio di DNA; uso di coloranti intercalanti; elettroforesi su gel di agarosio;
2. manipolazione di molecole di DNA: preparazione di frammenti di DNA tramite reazioni di restrizione o di PCR; reazioni di ligazione di DNA da subclonare in un vettore plasmidico e sua introduzione in E. coli;
3. purificazione, amplificazione e caratterizzazione di molecole di DNA: metodi di preparazione di DNA plasmidico ricombinante dai trasformanti e sua caratterizzazione mediante analisi di restrizione seguita da gel di agarosio;
4. uso di semplici tools bioinformatica per l’analisi di acidi nucleici e la progettazione di strategie di sub clonaggio.
LTA GENETICHE
Il programma verrà sviluppato per gruppi di non più di 50 studenti e c
