Tecnologie biomolecolari:
1) TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE:
a) enzimi per la manipolazione del DNA: DNA polimerasi (T4 DNA pol. e T7 DNA pol., Klenow, trascrittasi inversa), RNA polimerasi (T7 RNA pol. e T3 RNA pol.), nucleasi (DNasi, RNasi A/H, nucleasi S1), Transferasi terminale, Ligasi (T4 DNA ligasi), Chinasi (T4 polinucleotide chinasi); fosfatasi (Fosfatasi alcalina), endonucleasi di restrizione, Metilasi (dam, dcm e associate ad enzimi di restrizione);
b) vettori per il clonaggio: plasmidi e vettori fagici (E. coli come ospite);
c) costruzione di librerie geniche: librerie di DNA genomico e di cDNA, clonaggio dei prodotti della PCR;
d) sonde geniche: sonde a DNA, marcatura delle sonde di DNA (marcatura terminale al 5’ o al 3’; marcatura random primer, nick translation), sonde a RNA, riboprobe.
TECNICHE BASATE SU IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI:
a) screening di librerie geniche: ibridazione su colonie e placche, selezione di librerie geniche mediante PCR, screening di librerie di espressione;
b) saggi “Northern” e “Southern” blot.
2) Reazione polimerasica a catena (PCR): concetti di base, fasi della PCR, progettazione di primers, sensibilità ed applicazioni. PCR asimmetrica e nested. mutagenesi mediante PCR. clonaggio dei prodotti di PCR.
3) Sequenziamento del DNA: concetti di base, sequenziamento di Sanger, sequenziamento di Maxam e Gilbert, sequenziamento automatico del DNA in fluorescenza.
Metodologie Biochimiche:
• Tecniche di lisi cellulare
• Centrifugazione (differenziale, zonale, isopicnica, ultracentrifuga analitica)
• Cromatografia (gel filtrazione, scambio ionico, fase inversa, affinità)
• Sistemi automatizzati per cromatografia (HPLC e FPLC)
• Elettroforesi (SDS-PAGE, non denaturante, isoelettrofocalizzazione, gel bidimensionali)
• Western blot
• Immunoprecipitazione
• Accenni di tecniche radiochimiche
• Tecniche spettroscopiche (assorbimento, fluorescenza, dicroismo circolare, surface plasmon resonance)
• Spettrometria di massa (MALDI, ESI)
• Calorimetria (DSC, ITC)
