1. Analisi qualitativa e quantitativa della trascrizione. Northern relativa, Dot blot (ASO probe/diagnosi talassemie), RT-PCR relativa, RT-PCR applicazioni, RACE. Attività di un promotore tramite geni reporter. Cenni sull’uso dei microarray per lo studio dell’espressione genica. Librerie a cDNA mediante RT-PCR. Tagged random primers-PCR.
2. Metodi di studio delle interazioni fra macromolecole. One-hybrid (DNA-proteina). Two-hybrid originale, reverse e split hybrid (proteina-proteina). Two-hybrid alternativi (Sos recruitment, Split-ubiquitin). Three hybrid (proteine-proteine, RNA-proteine).
3. Sistemi di espressione in procarioti. Espressione di proteine in Escherichia coli. Promotori inducibili. Sistemi di fusione per la purificazione di proteine (Ubiquitina, IMPACT).
4. Sistemi di espressione in eucarioti. Espressione in lievito. Marcatori auxotrofici e dominanti. Vettori (integrativi, episomici, YAC). Biologia del 2 micron. Gene targeting. Pop-in e Pop-out. Vettori di espressione per lievito: promotori costitutivi ed inducibili. Sistema GAL. Plasmid shuffling. Vettori ad autoselezione. Espressione di proteine sia intracellulari che secrete (pathway secretivo e modificazioni co/post-traduzionali delle proteine). Parete cellulare. Yeast-based screening. Yeast surface display: applicazioni.
Espressione in cellule di mammifero. Sistemi di trasfezione di lineee cellulari di mammifero. Espressione transiente e trasformanti stabili; marcatori di selezione (tk, dhfr e marcatori dominanti). Promotori costitutivi ed inducibili (Tet-on e Tet-off).
Espressione in cellule di insetto: il sistema del baculovirus.